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Aug 19, 2023

Durch ein azelluläres Gerüst induzierte Valvulogenese einer lebenden, innervierten Lungenwurzel

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 1017 (2023) Diesen Artikel zitieren 333 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Herzklappenerkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität

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Herzklappenerkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität, ohne dass es eine wirksame medizinische Therapie und keinen idealen Klappenersatz gibt, der die äußerst anspruchsvollen Funktionen einer lebenden Herzklappe nachahmt. Diese Funktionen beeinflussen das Überleben und die Lebensqualität. Dies hat umfangreiche Versuche zum Tissue Engineering „lebender“ Herzklappen angeregt. Diese Versuche nutzten Kombinationen aus allogenen/autologen Zellen und biologischen Gerüsten mit praktischen, regulatorischen und ethischen Aspekten. Die In-situ-Regeneration hängt von Gerüsten ab, die Zellen anziehen, beherbergen und instruieren und die Bildung von Bindegewebe fördern. Wir beschreiben ein chirurgisches, aus Gewebe hergestelltes, anatomisch präzises, neuartiges, handelsübliches, azelluläres, synthetisches Gerüst, das einen schnellen Prozess der Morphogenese induziert, an dem relevante Zelltypen, extrazelluläre Matrix, regulatorische Elemente einschließlich Nerven und humorale Komponenten beteiligt sind. Dieser Prozess basiert auf spezifischen Materialeigenschaften, Design und „Morphodynamik“.

Herzklappenerkrankungen sind weiterhin weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität1 und es gibt keine wirksame pharmakologische Therapie zur Behandlung von Klappenerkrankungen. Chirurgischer oder perkutaner Klappenersatz sind die einzigen verfügbaren Methoden zur Behandlung von Patienten mit fortgeschrittener Herzklappenerkrankung. Bisher gibt es keinen idealen Herzklappenersatz2,3. Native Herzklappen erfüllen äußerst anspruchsvolle Funktionen4, die von der Funktionsfähigkeit ihrer Komponenten2 abhängen. Diese Funktionen führen zu wichtigen Endpunkten wie Langlebigkeit und Lebensqualität2,5. Dies hat umfangreiche Versuche zum Tissue Engineering eines lebenden Herzklappenersatzes angeregt, der in der Lage ist, die meisten oder alle Funktionen der lebenden natürlichen Klappe zu reproduzieren. Die meisten dieser Versuche beruhten auf der Verwendung verschiedener Zellen in Kombination mit einer Vielzahl von Gerüsten6,7,8,9 oder dezellularisierten Gerüsten10,11,12,13. Die Verwendung von Zellen und/oder Gerüsten tierischen Ursprungs in der Gewebezüchtung hat erhebliche Nachteile, z. B. den Ausschluss einer Standardverwendung, sowie ethische und praktische Probleme. Die In-situ-Regeneration14,15,16,17,18,19 bietet eine Plattform zur Vermeidung der Verwendung exogener Zellen. Die genauen Methoden zur Erreichung dieses Ziels sind noch nicht definiert5,20 und die beteiligten Mechanismen sind unbekannt. Die durch Gewebezüchtung hergestellten Klappen der nächsten Generation15,21 sollten über eine Reparatur-, Umbau- und Regenerationsfähigkeit verfügen, die den Eigenschaften einer lebenden Klappe2 nachempfunden ist, und ein Leben lang des Patienten halten21. Wir beschreiben hier das Design der Heart Biotech Composite Component Valve (HCCV), die aus einem mehrschichtigen, neuartigen, strahlgesprühten Polycaprolacton (PCL)-Gerüst22 besteht, das die Valvulogenese in vivo stimuliert. Dies wird in einem Schafmodell räumlich und zeitlich detailliert dargestellt, und wir diskutieren die beteiligten Mechanismen. Darüber hinaus präsentieren und diskutieren wir die In-vitro- und In-vivo-Funktionalität des HCCV.

Das HCCV ist eine Herzklappe aus PCL-Verbundkomponenten, die geometrisch auf die natürliche menschliche Halbmondklappe zugeschnitten ist.

Das Gerüst besteht aus einem biokompatiblen, bioresorbierbaren, azellulären, porösen PCL-Gerüst mit der spezifischen Geometrie einer menschlichen, natürlichen Halbmondklappe. Dies basierte auf der 3D-Rekonstruktion von Bildern normaler Aortenwurzeln, die nach ethischer Genehmigung vom Assuan-Herzzentrum erhalten wurden (Abb. 1a, b). Das Design wurde leicht modifiziert, um die Längskrümmung der Valsalva-Nebenhöhlen und die Höhe der Segel zu verstärken, um die Wechselwirkung zwischen Flüssigkeit und Feststoff zu verbessern und die Koaptation zu verbessern23 (Abb. 1c). Es wurde ein computergestütztes Designmodell (CAD) mit einer Ringgröße von 25 mm erstellt, das die äußere Geometrie (Abb. 1d) sowie die Segeloberflächen (Abb. 1e) darstellt. In wasserlöslichem Polyvinylalkohol (PVA) wurden Formen eines Drittels der Klappe, bestehend aus einer Kombination aus Sinus und Segel, 3D-gedruckt und so angepasst, dass sie in einen Halter und ein Gegengewicht passten (Abb. 1e). Jede Sinus-/Blattform wurde mit nanofaserigem PCL besprüht. Die Nanofasern wurden strahlgesprüht, um ein anisotropes Gerüst mit Fasern überwiegend in Umfangsrichtung zu erzeugen. Drei Sinus-/Faltblattformen wurden in einen Halter eingebettet (Abb. 1f) und diese Anordnung wurde strahlgesprüht (Abb. 1g). Eine gestrickte Stütze (Patent EP 3 552 577 B1) mit proximalen und distalen Nähringen wurde auf die Nebenhöhlen gelegt (Abb. 1h) und diese erneut besprüht. Die gestrickte PCL-Stütze wurde durch Kettenstricken im Jersey-Design unter Verwendung von PCL-Garn hergestellt, um eine Ausdehnung in Umfangsrichtung zu ermöglichen (Abb. 1i). Die PVA-Formen wurden durch Auflösen in Wasser entfernt, um das HCCV freizulegen (Abb. 1j – l). Die Sinuswände bestanden aus einem gestrickten Träger, der in strahlgesprühte PCL-Nanofasern eingebettet war (Abb. 1m), und die Blättchen bestanden nur aus strahlgesprühten Nanofasern. Zur Charakterisierung der Nanofasergröße (Mittelwert 0,38 µm (± 0,02)) wurde SEM verwendet, und repräsentative Bilder des PCL-Nanofasergerüsts (Abb. 1n – p) zeigten, dass der Porendurchmesser eine mittlere Größe von 0,32 µm (± 0,03) mit Median hatte von 0,24 µm (±0,04) (Abb. 1q) und unterschiedlicher Form (Abb. 1o).

Ein CT-gescanntes Bild einer normalen Aortenwurzel, das als Vorlage für die Gestaltung des HCCV a dient; Segmentierung der Wurzelregion b; 2D-Zeichnung der Komponenten des HCCV (alle Einheiten in mm) c; 3D-Computergestütztes Design (CAD) der Außengeometrie d; Klappenbaugruppe, bei der ein Drittel des HCCV in der Form eines einzelnen Sinus, eines Segels und eines Drittels der aufsteigenden Arterie modelliert wurde und drei dieser Sinusmodelle zusammengesetzt wurden, um das vollständige HCCV zu erstellen. Zur Aufnahme der drei Sinusmodelle und zur Bildung der aufsteigenden Arterie wurde ein Halter entwickelt. Eine Gegenform wurde so entworfen, dass sie komplementär zu den Nebenhöhlen passt, um die Interleaflet-Dreiecke und den Annulus e zu bilden. Drei strahlgespritzte Sinusformen, untergebracht im Halter (oben) mit der Gegenform (unten) f. Der gesamte Formaufbau wird mit der gewirkten Unterlage h besprüht. Bilder, die das Design der gestrickten Stütze zeigen, mit 2 Sinusansichten (oben) und einer Sinusansicht (unten) mit Vergrößerungsbereichen der verschiedenen Regionen i. Endgültiges HCCV nach der Auflösung der PVA-Formen j, Draufsicht k und Ringansicht l. REM durch die Wand des Sinus, das den gestrickten PCL-Träger (untere Fasern) und die Nanofasern (oben) × 150 m zeigt. SEM von Nanofasern x5000 n; Analyse der Leerräume zwischen den Nanofasern o, Schwellenwertbild p und ein Histogramm der Porengrößenverteilung (alle Daten werden als Mittelwert (±SD), n = 5, unabhängige Proben dargestellt) q. Repräsentative Druck-Fluss-Beziehungen der Medtronic Freestyle-Klappe und des HCCV r. Repräsentative geometrische Bereiche der 3 Blättchen s. Dem Öffnungsbereich jedes Blättchens wurden drei verschiedene Farben zugewiesen, um die Synchronisierung zwischen der Medtronic Freestyle-Klappe (oben, n = 1) und dem HCCV (unten, n = 1) anzuzeigen. Risse (angezeigt durch schwarzen Kreis) in 2 HCCVs nach 9 Millionen Zyklen im beschleunigten Verschleißtestgerät t. Querschnitt des HCCV mit starker Vergrößerung der Sinuswand, der die gestrickte Stütze zeigt, die in Nanofasern eingebettet ist.

Hydrodynamische Tests des HCCV-Gerüsts (n = 4) und des Medtronic Freestyle 25 mm (n = 4) ergaben eine ausreichende effektive Öffnungsfläche von 2,15 cm2 (±0,06) bzw. 2,04 cm2 (±0,41), p = ns; triviale bis leichte Lungeninsuffizienz, 11,47 % (±0,58) bzw. 4,56 % (±1,28), p = 0,0001; Schließvolumina von −7,02 ml (±1,75) bzw. −0,82 ml (±0,23), p = 0,0004; Leckagevolumina von –4,47 ml (±2,05) und –3,73 ml (±1,07), p = ns (Tabelle 1, Abb. 1r). Der maximale systolische Druckgradient von HCCV und Medtronic Freestyle betrug 23,37 mmHg (±1,11) bzw. 23,46 mmHg (±3,43), p = ns. Die augenblickliche Bewegung der Blättchen zeigte einen hohen Grad an Synchronität zwischen den drei Blättchen während des Öffnens (Abb. 1s). Die mit einer Hochgeschwindigkeitskamera bestimmte Klappensegelkinetik (Zusatzvideo 2 und 3) zeigte, dass die geometrische Öffnungsfläche der HCCV- und Medtronic-Freestyle-Klappe 3,13 cm2 (±0,14) bzw. 2,21 cm2 (±0,14) betrug, p = 0,0001. Die Öffnungsdauer der HCCV- und Medtronic Freestyle-Klappensegel betrug 0,325 s (± 0,014) bzw. 0,302 s (± 0,018), p = ns. Die Öffnungsrate der HCCV- und Freestyle-Klappensegel betrug 74,15 cm2/s (±13,00) bzw. 56,73 cm2/s (±11,42), p = ns. Die Schließrate der HCCV- und Medtronic Freestyle-Klappensegel betrug −29,54 cm2/s (±5,92) bzw. −22,99 cm2/s (±2,72), p = ns. Haltbarkeitstests des unbesiedelten HCCV zeigten eine anhaltende Funktionalität bis zu 9 Millionen Zyklen, was einem Zeitraum von 3 Monaten entspricht. Zu diesem Zeitpunkt wurden kleine Risse im Bauchbereich beobachtet (Abb. 1t). Die Mikrostruktur des HCCV-Gerüsts zeigte eine Schichtung der Nanofasern und des makrofaserigen gestrickten Trägers (Abb. 1u).

Nach dem Einführen des HCCV in die Lungenposition wird ein schnelles Wiederbesiedlungsprogramm eingeleitet, und zwar gleichzeitig von der luminalen und der Adventitialseite. HCCV wurden in Abständen von 1 Woche (n = 1), 2 Wochen (n = 1), 3 Wochen (n = 1), 9 Wochen (n = 1), 12 (n = 7) und 26 Wochen (n) explantiert = 4) (Ergänzende Abbildung 1).

Bei der Implantation zeigte das HCCV eine gute sichtbare Funktion ohne Undichtigkeiten an den Anastomosenringen (Zusatzvideo 1) (Abb. 2a). 26 Wochen nach der Implantation zeigten die Sinuswände eine signifikante Zunahme der Dicke von 1,75 mm (±0,27) vor dem Einsetzen auf 6,76 mm (±1,28) (p < 0,0001) bzw. 5,35 mm (±1,70) (p < 0,0001). ) und 5,03 mm (±2,02) (p = 0,0001) nach dem Einsetzen für den vorderen, linken bzw. rechten Sinus (Abb. 2b). Alle Blättchen erfuhren 6 Monate nach der Implantation einen geringfügigen, nicht signifikanten Grad der Retraktion von der ursprünglichen Höhe von 17,40 mm (±0,00): Die Vorderseite zog sich auf eine mittlere Höhe von 13,60 mm (±1,37 mm) zurück, die linke Seite zeigte Das Blättchen wurde auf einen Mittelwert von 15,20 mm (±2,83 mm) zurückgezogen und die nach rechts gerichteten Blättchen wurden auf eine Höhe von 13,80 mm (±4,31 mm) zurückgezogen (Abb. 2c). Es gab einen signifikanten Anstieg der Dicke des Segels von durchschnittlich 0,62 mm (±0,02 mm) vor der Implantation auf durchschnittlich 1,25 mm (±0,82 mm) 6 Monate nach der Implantation, p < 0,0001. Bei der Explantation zeigte das grobe Erscheinungsbild des HCCV zu allen Zeitpunkten keine Anzeichen von Verkalkung oder Thromben (Abb. 2d – l). Die Oberflächen waren glatt und die Form der Nebenhöhlen blieb erhalten. Die Blättchen waren dünn, biegsam mit glänzender Oberfläche und guter Koaptation (2–4 mm). 8 der 15 HCCV hatten kleine Risse, wobei 1 HCCV in der 9. Woche (1 Blättchen), 5 HCCV in der 12. Woche (7 Blättchen) und 2 HCCV in der 26. Woche (2 Blättchen) (2–3 mm lang) ihren Ursprung in den Höckern hatten von der Verbindungskante (Abb. 2i–l). Bei der weiteren Analyse zeigte das 9-Wochen-Explantat Hinweise auf eine Infektion in den Blättchen, nicht jedoch in der Wand.

Die funktionelle implantierte Ansicht von HCCV unmittelbar nach der Implantation a. Diagramme, die die mittlere Sinusdicke b und die mittlere Segellänge c 26 Wochen nach der Implantation zeigen, n = 4 (Mittelwert ± SD) biologisch unabhängige Proben) unter Verwendung einer einfachen ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. Die arterielle Ansicht von HCCV 1 Woche nach der Implantation d. Offene Ansichten von 4 HCCV 26 Wochen nach der Implantation, geordnet anterior, rechts posterior und links posterior für jedes HCCV e–h. Broschüren, die die Position der Risse 9 Wochen i, 12 Wochen j, k und 26 Wochen l nach der Implantation zeigen.

Bei der einwöchigen Explantation waren die frühesten Zellen, die in der Sinuswand auftraten, aus dem Knochenmark stammende CD45-positive Zellen (Pan-Leukozyten-Marker) in größerer Zahl von der Adventitia-Seite (Abb. 3a), wobei einige Zellen in die Mitte der Sinuswand eindrangen Gerüst und innerhalb des gestrickten Trägers (Informationen zu Antikörpern finden Sie in der Ergänzungstabelle 1). Darüber hinaus gab es einige positiv mit α-SMA gefärbte Myofibroblasten mit früher Kollagenablagerung (Abb. 3b) nur in fleckigen Bereichen auf der Lumenseite.

1 Woche nach der Implantation von HCCV mit repräsentativen Sinuswandbildern für CD45-Immunfärbung a, Kollagen durch EVG (*) auf der Lumenseite b; 2 Wochen nach der Implantation (ABSR- und Hämatoxylin-Färbung) c, vergrößerte Kästchen in c d. Zellen, die α-SMA e exprimieren, TEM mit Fibroblasten-f- und Myofibroblasten-g-Morphologie, ECs (CD31), die neue Gefäße (*) auskleiden h, M1-Makrophagen-Expression i, M2-Makrophagen-Expression j, neues Gefäß (*) und angrenzender Perizyt k, TEM zeigt Perizyten neben ECs l, m mit Stift-/Buchsenverbindungen (rote Kreise). Kollagen n und Elastogenese in Neo-Gefäßen (*) o, Neo-Intima (Pfeil zeigt Elastin an) p, Neo-Media q, unvollständige Kapsel (*) r, Adipogenese in der Neo-Adventitia (*) s durch EVG. 3 Wochen nach der Implantation zeigen sich Lamellen in neuen Gefäßen (EVG) t, α-SMA u und SMM v durch Immunfärbung, Kollagen EVG w im gestrickten Bereich, Elastinhülle am äußeren Strick (EVG) x, Nervenbündel gefärbt mit Neurofilamentprotein y und FBGCs (*) z. # Zeigt die Adventivseite an. Maßstabsbalken: 250 µm auf a, b, h, m, q, v; 500 µm in c, I; 100 µm in d, e, r, s, t, u; 1 µm in f, g, l; 5 µm in k; 25 µm in j, p; 50 µm in n, o, x, y und 1mmm in w. E steht für ECs und P für Perizyten.

In der zweiten Woche wurde die Sinuswand in zwei Schichten umgestaltet, bestehend aus einer Neomedia mit der gestrickten Stütze und einer Neoadventitia mit begleitender Kollagenablagerung (Abb. 3c). Insbesondere auf der Neo-Adventitia (Abb. 3c) gab es eine größere Häufigkeit besiedelnder Zellen als auf der luminalen Seite (Abb. 3d). Die besiedelten Zellen hatten unterschiedliche Phänotypen (CD45-Zellen (Pan-Leukozytenmarker), Myofibroblasten (SMA-positiv) (Abb. 3e, f), Fibroblasten (Abb. 3g), Endothelzellen (CD31) (Abb. 3h) und klassisch aktivierte proinflammatorische M1-Makrophagen (CCR7) (Abb. 3i) und alternativ aktivierte entzündungshemmende M2-Makrophagen (CD163) (Abb. 3j). CD163 wurde häufiger exprimiert als CCR7. Es gab auch seltene mehrkernige Fremdkörper-Riesenzellen (FBGCs). entdeckt. Neoangiogenese wurde in diesem frühen Stadium beobachtet, wobei eine einzelne Endothelauskleidung vorhanden war (Abb. 3h, k). Diese wurden innerhalb der Neoadventitia bis zur luminalen Seite der gestrickten Stütze gesehen. Wichtig ist, dass diese Neogefäße dies zeigten Vorhandensein peripherer Perizyten über Zapfen- und Sockelverbindungen zu Endothelzellen (ECs) auf ihren abluminalen Seiten (Abb. 3k–m). Das Auftreten von Adipogenese wurde erstmals an den proximalen und distalen Rändern des HCCV innerhalb der Neoadventitia beobachtet, die sich beherbergt Neogefäße (Abb. 3e, s).

Zu diesem Zeitpunkt wurden Kollagenfasern überwiegend in Längsrichtung auf beiden Seiten des gestrickten Trägers nachgewiesen, wobei sich Längsfasern über den gestrickten Träger erstreckten (Abb. 3n). Elastogenese in Form feiner Elastinfasern wurde in den Neogefäßen (Abb. 3o), Neointima (Abb. 3p), Neomedia (Abb. 3q) und am Anfang einer unvollständigen Hülle im Gefäß beobachtet äußere Neoadventitia (Abb. 3r).

Das 3-wöchige Explantat war durch eine weitere Entwicklung der Arterienwand und der Vasa vasorum mit den Anfängen von Lamellen (Abb. 3t) in der Media und Adventitia gekennzeichnet, die glatte Muskelzellen (SMCs) enthielten, die α-SMA stark exprimierten (Abb. 3u). und eine etwas schwächere Expression von Glattmuskel-Myosin (SMM) (Abb. 3v). Die meisten Zellen in den Neomedien zeigten eine positive Färbung auf α-SMA und SMM. Eine weitere Ablagerung von Kollagen auf beiden Seiten des gestrickten Trägers durch Fibroblasten und Myofibroblasten wurde insbesondere auf der Adventitia-Seite mit dickeren Kollagenbrücken über dem gestrickten Träger beobachtet (Abb. 3w, x). Damit einher ging eine weitere Elastogenese in Form einer dünnen Hülle (Abb. 3x) im Außengestrick, die die äußere elastische Lamina simulierte.

Ein neues und aufregendes Merkmal war das Auftreten einer kleinen Gruppe nicht myelinisierter Nervenbündel (300–400 µm Durchmesser), die das neuronale Marker-Neurofilamentprotein (Abb. 3y) schwach exprimierten und in situ im neu gebildeten Fettgewebe neben Neogefäßen gebildet wurden. Die Anzahl mehrkerniger FBGCs (Abb. 3z) sowie M1- und M2-Makrophagen nahm in der Adventitia und im gestrickten Träger zu.

Das 9-wöchige Explantat zeigte eine verbesserte Kollagensynthese in der gestrickten Stütze und der äußeren Adventitia (Abb. 4a). Eine Ausdehnung der mit Neurofilamentprotein gefärbten Nervenbündel (Abb. 4b) in Anzahl (5–12) und Größe (40 µm–1,3 mm Durchmesser) wurde im äußeren Sinus neben großen Gefäßen und im mit FABP4 gefärbten Fettgewebe beobachtet (Abb. 4c) und Leptin (Abb. 4d). Die Sinuswand war vollständig zellularisiert (Abb. 4e) mit einer Kombination aus Fibroblasten, Myofibroblasten (Färbung positiv für α-SMA) und Makrophagen M1, M2 und einer Schicht aus FBGCs, die die äußere Neomedia auskleidete (Abb. 4e). Zum ersten Mal wurden eine fleckige Schicht quaderförmiger Endothelzellen (ECs), die vWF exprimieren, auf der Oberfläche der Sinuswand (Abb. 4f) und gelegentliche longitudinale ECs auf den Blättchen (Abb. 4g) nachgewiesen. Wichtig ist, dass diese Zellen die Morphologie (Abb. 4h, i) und die Ultrastruktur normaler ECs (Abb. 4j) aufwiesen. Auf der Außenfläche der Adventitia einer Sinuswand befand sich eine unvollständige Hülle aus Kollagen und elastischen Fasern (Abb. 4k). Alle repopulierenden Zellen und ECM schienen aus dem Kreislauf und den umgebenden Geweben an den Anastomosestellen zu stammen.

HCCV zeigt Kollagenablagerungen, gefärbt durch EVG a, Nervenbündel, immungefärbt, gefärbt mit Neurofilamentprotein b, eingebettet in expandierendes Fettgewebe, gefärbt mit FABP4 auf der Adventitialseite c 9 Wochen nach der Implantation und Leptin d 12 Wochen nach der Implantation. Vollständige Zellularisierung der Sinuswand, gefärbt mit H&E, zeigt eine Schicht multizellulärer FBGCs (*) e, quaderförmige ECs auf der Sinuswand f, Längs-ECs auf der Arterienseite der Segel, g gefärbt mit CD31, SEM von ECs auf der Sinuswand h , i, TEM von EC j 9 Wochen nach der Implantation, unvollständige Elastinkapsel gefärbt mit EVG k 9 Wochen nach der Implantation, Nervenbündel gefärbt mit VIP l, TH m, NPY n und Neurofilamentprotein o 12 Wochen nach der Implantation Implantation. Maßstabsbalken: 500 µm in a, b und k; 250 µm in l, m, n, o; 100 µm in c, d, e, f, g; 10 µm auf Panel h; 5 µm in i und 0,5 µm in j.

Die 7 Explantate 12 Wochen nach der Implantation zeigten eine anhaltende Umgestaltung und Stärkung durch Kollagen. Es gab viele Nervenbündel (~ 20) in den Nebenhöhlen aller 7 HCCV, die positiv auf vasointestinales Peptid (VIP) (Abb. 4l), Tyrosinhydroxylase (TH) (Abb. 4m) und Neuropeptid Y (NPY) (Abb. 4n) und Neurofilamentprotein (NF) (Abb. 4o). VIP und NPY färbten auch einige der SMCs des Gefäßsystems (Abb. 4l, n). Das Gerüst wurde von FBGC in der gesamten Wand der Nebenhöhlen und bis zur Gelenkregion besiedelt. An den Sinuswänden wurde eine kontinuierliche Schicht von ECs beobachtet, die über einer Faserschicht aus Myofibroblasten und Fibroblasten lag. Die meisten arteriellen Seiten der Segel waren mit ECs bedeckt (Abb. 4g).

In der 26. Woche kam es zu einer weiteren Reifung aller Schichten der Sinuswand sowie der Zell- und ECM-Komponenten, wodurch die Arterienwand durch die Verflechtung von Kollagenfasern, elastischem Gewebe und SMCs stark gestützt wurde. Zu diesem Zeitpunkt gab es eine sehr gut entwickelte Adventitiaschicht, die die regulatorischen Elemente wie Nerven, Vasa vasorum und weißes Fettgewebe enthielt (Abb. 5a). Drei der vier Explantate zeigten nach 26 Wochen das Vorhandensein vieler Nervenbündel, die in jedem Bündel in unterschiedlichem Maße positiv für Tyrosinhydroxylase (Abb. 5b), Neuropeptid Y (Abb. 5c) und Neurofilamentprotein (Abb. 5d) waren als positive Färbung für Silber, die Marker für reifes Nervengewebe sind (Abb. 5e). Die Ultrastruktur von Axonen und Schwann-Zellen wurde auch durch Elektronenmikroskopie bestätigt (Abb. 5f, g).

HCCV zeigt die Reifung der Gefäße in der Adventitia-Fettschicht neben einem mit EVG a gefärbten Nervenbündel; Tyrosinhydroxylase-immungefärbtes Nervenbündel b, Neuropeptid Y c, Neurofilamentprotein d, silbergefärbtes Nervenbündel e, Ultrastruktur von Nervenbündeln durch TEM f, g, VwF-Immunfärbung an der Sinuswand h, arterielle Seite des Segels i, EVG-gefärbte EC-Basalmembran j , Elastin-Immunfärbung k, α-SMA l, SMM m, Koexpression von CD31 (rot) und α-SMA (grün) n, vollständiger Wurzelabschnitt mit Fettgewebe, Elastin- und Kollagenfärbung durch EVG o, vergrößerte Felder mit Fettgewebe mit Nervenbündeln und Gefäßen p, Kollagen kriecht auf der ventrikulären Seite des Blättchens q. Zurückgezogenes Segel r, normale Lungenwurzel s, das Fettgewebe zeigt, in dem sich ein Nervenbündel und Gefäße in unmittelbarer Nähe befinden, mit vergrößertem Bild t. HCCV-Blattblättchen immungefärbt mit α-SMA u, CD163 v. Die Oberseite in u und v ist die arterielle Seite des Blättchens. Maßstabsbalken: 100 µm in a–c; 50 µm in d, e, h, i, j, k, l, m; 2 µm in f; 5 µm in g; 20 µm in n; 10 µm in o; 1 mm in p, q; 2,5 mm in s; 500 µm in u und 250 µm in v.

An der Sinuswand bildete sich eine durchgehende, mit vWF gefärbte Endothelauskleidung (Abb. 5h) mit einer gut definierten Intimalschicht und einer inneren elastischen Lamina (Abb. 5j). Die Endothelauskleidung (vWF) auf den Blättchen war nahezu vollständig (Abb. 5i). ECs und Intima exprimierten Elastin (Abb. 5k), α-SMA (Abb. 5l) und SMM (Abb. 5m) auf den Nebenhöhlen (ähnlich einer normalen Schafsnebenhöhlenwand (ergänzende Abb. 2)). ECs auf der luminalen Seite der Sinuswand und der Mikrogefäße zeigten eine Endothel-zu-Mesenchym-Transformation (EndMT) durch die Koexpression des EC-Markers (CD31) und des mesenchymalen Markers α-SMA (Abb. 5n). Fibroblasten, die anhand ihrer Morphologie und Ultrastruktur mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie nachgewiesen wurden (Abb. 5g), und Myofibroblasten, die mithilfe von α-SMA ohne die Anwesenheit von SMM nachgewiesen wurden, wurden in der gesamten Sinuswand gefunden, einschließlich in der fibrotischen Schicht, die sich unter dem Sinusendothel befindet. auf beiden Seiten des Gerüsts, innerhalb der gestrickten Schicht, der Neomedia und der Adventitia. Es gab eine erhöhte Menge an Fettgewebe (Abb. 5o, p), ähnlich einer normalen Lungenhöhlenwand (Abb. 5s, t). Dieses enthielt weiße Adipozyten, in denen sich Neuronen und Gefäße befanden (Abb. 5o, p). Die Gelenkregion wurde durch eine Kollagenschicht entlang des Ventricularis gestützt (Abb. 5p, q). Von den 4 nach 26 Wochen explantierten HCCV-Zellen zeigte nur eines von 12 Segeln eine Retraktion (Abb. 5r).

In den Blättchen kam es zu keiner Ablagerung von Kollagen, Elastin oder Proteoglykanen. Die Zellen hatten überwiegend den myofibroblastischen (Abb. 5u), fibroblastischen, endothelialen, M2- (Abb. 5v) und FBGC-Phänotyp mit abnehmender Häufigkeit. Die Scharnierregion folgt einem langsamen Rezellularisierungsprozess, der dem in den Blättchen beobachteten ähnelt.

Die In-vivo-Echokardiographie des HCCV zeigte eine gute Bewegung und Koaptation der Segel bei minimaler Regurgitation (Abb. 6a – l, ergänzende Abb. 4). Die mittels MRT erzeugte Geometrie und Funktion zeigte eine erhaltene Wurzelform mit ausgeprägten Nebenhöhlen (Abb. 6m), eine erhaltene Größe und Funktion des rechten Ventrikels (Abb. 6n) mit erhaltenen endsystolischen (ES) und enddiastolischen (ED) Volumina. Es gab keine Hinweise auf eine Stenose oder Regurgitation des HCCV. Es gab eine hervorragende Größenübereinstimmung zwischen dem HCCV und dem rechtsventrikulären Ausflusstrakt (Abb. 6m). Die Bestimmung des momentanen Flusses mittels MRT zeigte nahezu normale Spuren (Abb. 6o). Computational Fluid Dynamics (CFD) zeigte parallele Stromlinien in der Hauptpulmonalarterie während der systolischen Phase und eine Doppelhelixbildung in den Hauptästen während der Diastole (Abb. 6p), während sie keine abnormale Beschleunigung wie bei normalen Schafen (Kontrolle) zeigte (Abb . 6q). Die Stammanalyse der HCCV-Wurzeln wurde mittels MRT an der maximalen Ausbuchtung des Sinus pulmonalis während des Herzzyklus durchgeführt. Die nach 6 Monaten gemessene Belastung für HCCVs (n = 5) betrug 0,42 (± 0,16) im Vergleich zu 0,51 (± 0,08) bei einheimischen Schafen (n = 3), obwohl es offenbar eine Abnahme der Belastung für die HCCV-Wurzel gibt Der Unterschied ist statistisch nicht signifikant.

Die erste Reihe zeigt die Echokardiogramme des HCCV bei der Implantation während Systole a und Diastole b, gefolgt von Doppler-Ultraschall, der laminare Strömung während Systole c und minimale Regurgitation während Diastole d zeigt. Die zweite Zeile zeigt den HCCV nach 2 Monaten während Systole e und Diastole f, gefolgt von Doppler-Ultraschall während Systole g und Diastole h. Die dritte Reihe zeigt den HCCV nach 6 Monaten während Systole i und Diastole j, gefolgt von Doppler-Ultraschall, der Systole k und Spuren von Regurgitation während Diastole l zeigt. MRT erzeugte Wurzelgeometrie von 3 HCCVs und einer Kontrolle 26 Wochen nach der Implantation m. MRT-generiertes Ventrikulogramm, das den rechten (gelb) und linken (rot) Ventrikel in 3 HCCV und einer Kontrolle zeigt des Flusses durch die Lungenarteriengabelung eines HCCV und zwei gegenüberliegende Wirbel p, CFD, das parallele Geschwindigkeitsstromlinien in einer Kontrolle (normales Schaf) und durch 2 HCCVs bei der Spitzensystole 6 Monate nach der Implantation q zeigt. Molekulargewicht der ursprünglichen und nach 26 Wochen implantierten PCL-Nanofasern in Segeln, Nebenhöhlen und gestrickten Trägern (alle Daten werden mit Mittelwert ± SD dargestellt, n = 3, (biologisch unabhängige Proben) r, SEM-Analyse von gestrickten Fasern vor und nach der Implantation bei ×1000 (rote Pfeile zeigen Erosion an), SEM von Nanofasern vor u- und nach v-Implantation bei ×5000 (roter Pfeil zeigt „Lochfraß“ an). Maßstabsbalken sind 5 µm in s und t; 10 µm in u und v.

Die Gelpermeationschromatographie zeigte nach 6 Monaten einen signifikanten PCL-Nanofaserabbau von der ursprünglichen PCL-Nanofaser mit einem durchschnittlichen MW von 118374 Da (±1349) bis zu einem durchschnittlichen MW von 99734 Da (±3070) für Nanofasern in Blättchen (p = 0,0029) und einem durchschnittlichen MW von 102573 Da (±8726) für Sinuswände (p = 0,0091) (Abb. 6r). Es gab keinen signifikanten Unterschied in den MWs zwischen den in den Segeln getesteten Proben und den in den Nebenhöhlen getesteten Proben nach 6 Monaten Implantation. Der PCL-Strickträger zeigte nach 6 Monaten einen langsamen Abbau vom ursprünglichen Träger mit einem durchschnittlichen MW von 80554 Da (±708) auf einen durchschnittlichen MW von 63489 Da (±2983), p = 0,0054 (Abb. 6r). Die SEM-Analyse der gestrickten Fasern zeigte eine Verschlechterung ihrer glatten Oberfläche (Abb. 6s, t), während die Nanofasern nach 6-monatiger Implantation eine gewisse „Lochfraßbildung“ aufwiesen (Abb. 6u, v).

Von den 14 explantierten HCCV zeigte nur 1 Blättchen nach 6 Monaten einen sehr kleinen Verkalkungsknoten (500 µm Durchmesser), der die Klappenfunktion nicht beeinträchtigte (ergänzende Abbildung 3a – c). Es gab keine Anzeichen einer Verkalkung in den Nebenhöhlen.

Dieses Manuskript zeigt zum ersten Mal, dass nach dem Einsetzen eines azellulären Gerüsts mit spezifischem mehrschichtigem Design22,24 ein aktives Programm der Klappenmorphogenese stattfindet, das zu einer lebenden und funktionierenden Klappe führt. Das Design nutzt die Wechselwirkung zwischen Feststoff und Flüssigkeit23, Morphodynamismus4,23, Spannungsverteilung zwischen den Nebenhöhlen und den Segeln25 sowie die spezifische Größe und Form der Poren im Gerüst26,27.

Die In-vitro-Funktionalität des HCCV-Gerüsts zeigte im Vergleich zum Medtronic Freestyle eine ausreichende effektive Öffnungsfläche und einen ausreichenden systolischen Spitzendruckgradienten. Der Regurgitationsanteil des HCCV lag unter der ISO-Standardanforderung von 15 %, war jedoch deutlich höher als beim Medtronic Freestyle, was hauptsächlich auf das zunehmende Schließvolumen des HCCV zurückzuführen ist. Dies ist wahrscheinlich auf die deutlich größere geometrische Öffnungsfläche des HCCV zurückzuführen. Nach der Neubesiedlung des Gerüsts zeigten In-vivo-Studien jedoch eine leichte Regurgitation, die keinen Einfluss auf das Ventrikelvolumen hatte. In-vitro-Haltbarkeitstests des HCCV-Gerüsts zeigten eine Funktionalität von bis zu 9 Millionen Zyklen (entspricht einem Zeitraum von 3 Monaten normaler Herzzyklen), wobei zu diesem Zeitpunkt Risse auftraten. In vivo übertraf das HCCV diese jedoch aufgrund der Remodellierungsfähigkeit des Gerüsts mit einer guten funktionellen Leistung für bis zu 6 Monate. In ähnlicher Weise überschritt die dezellularisierte Tritube-Klappe die In-vitro-Zyklenzahl bis zum Versagen28. Die Funktionalität des HCCV blieb ebenfalls erhalten, was durch die Echoergebnisse bestätigt wurde, ohne Anzeichen einer Stenose oder einer signifikanten Regurgitation. Darüber hinaus zeigte die MRT, dass Größe und Form der Ventrikel erhalten blieben, was die gute Funktionalität des HCCV über den gesamten Implantationszeitraum hinweg belegt.

Das Umbauprogramm ist mit der Rekrutierung und Differenzierung von Zellen zum relevanten Phänotyp wie in der nativen Klappe wie SMCs, Myofibroblasten, Fibroblasten und ECs29,30,31 mit der Produktion und Schichtung der extrazellulären Matrixkomponenten verbunden. Die Schichtung in den HCCV-Blättern war nicht so ausgereift wie in normalen Lungenflügeln, die Schichtung in den HCCV-Sinuswänden war jedoch vergleichbar mit der einer normalen Pulmonal-Sinuswand mit definierten Intima-, Medial- und Adventitialschichten32,33. Die Klappenmorphogenese ist ein äußerst komplexer Prozess34, der genetische, mechanische und molekulare Wege mit Interaktionen mehrerer Zelltypen umfasst. Der durch das Gerüst induzierte räumlich-zeitliche Prozess der Morphogenese ist dem während der Klappenentwicklung ähnlich, aber nicht identisch34,35. Dazu gehören Interaktionen an der Zelloberfläche, zwischen Fibroblasten, aktivierten Myofibroblasten, Perizyten, ECs, Immunzellen, SMCs und ECM27,36. Wir beobachteten aktivierte Myofibroblasten 2 Wochen nach dem Einsetzen, deren Zahl im Laufe der Zeit zunahm, insbesondere in der Neoadventitialschicht, gefolgt von Neomedia und Neointima. Diese Zellen waren an der Produktion von Kollagen, Elastin und anderen Elementen der ECM beteiligt. ECs wurden nach 2 Wochen sowohl auf der Gerüstoberfläche als auch in den Neogefäßen nachgewiesen und zeigten nach 9 Wochen ein Kopfsteinpflaster-Erscheinungsbild, das CD31 exprimierte. Nach 12 Wochen befand sich an den Nebenhöhlenwänden eine fast vollständige EC-Schicht. Perizyten wurden neben den ECs der Neogefäße beobachtet. Es wird angenommen, dass ECs und Perizyten in den Neogefäßen eine entscheidende Rolle bei der Angiogenese und Adipogenese spielen37,38. Es ist bekannt, dass Perizyten die Entwicklung und Funktion von ECs in Arterienwänden beeinflussen39. Hinweise auf EndMT wurden erstmals nach 9 Wochen in den intimalen ECs beobachtet. EndMT spielt eine wichtige Rolle bei der Klappenbildung, indem es die Klappensegel mit neuen Zellen neu besiedelt und so langfristig die Klappenhomöostase beeinflusst34,40. Die neu gebildeten Gefäße waren eng mit Nervenbündeln verbunden. Die zelluläre Zusammensetzung der HCCV-Wand näherte sich nach 6 Monaten der der natürlichen Sinuswand an, mit ECs auf der Oberfläche, SMCs in der Media, Myofibroblasten, Fibroblasten, Adipozyten und Neuronen in der Adventitia. Allerdings blieben Makrophagen und Fremdkörper-Riesenzellen zum Zeitpunkt nach 6 Monaten bestehen. Es wurde gezeigt, dass Makrophagen die „Pionierzellen“ beim Umbau einer dezellularisierten Schweinepulmonalklappe sind12. Die Fremdkörperreaktion und die Wundheilung sind die am häufigsten vermuteten Mechanismen für die Integration und Umgestaltung des Gerüsts17,41,42.

Ein wichtiges Alleinstellungsmerkmal ist die Entwicklung von neurogenem Gewebe nach 3 Wochen, das mit der Zeit zunehmend zunimmt. Diese Nerven exprimierten mehrere Neurotransmitter, die eine wichtige Rolle bei der Reduzierung der Entzündungsreaktion spielen könnten43. Das Vorhandensein von Nerven wurde bei keiner anderen durch Gewebezüchtung hergestellten Klappe dokumentiert. Nerven spielen eine wichtige regulatorische Rolle bei der Entwicklung, Reifung und normalen Physiologie der Klappen44,45 und Nervenfasern haben nachweislich ihren Ursprung in der Adventitiawand46. In-situ-Neurogenese durch ein azelluläres, poröses Gerüst wurde gezeigt, jedoch in einem Modell einer Nervenverletzung47.

Weißes Fettgewebe wurde erstmals drei Wochen nach der Entwicklung der Angiogenese in der äußeren Neoadventitia beobachtet48. Dieses Fettgewebe kann zu einem einzigartigen mechanischen Verhalten der Sinuswand beitragen, das wie ein „Polster“ wirkt, ähnlich dem, das bei der normalen Sinuswand der Lunge beobachtet wird. Fettgewebe hat viele regulatorische und metabolische Funktionen, die für die Morphogenese und Funktion der reifen Klappe von Bedeutung sein könnten49 und wurden bei keiner anderen gewebetechnisch hergestellten Klappe dokumentiert. Die Entwicklung der Adventitia in durch Gewebezüchtung hergestellten Klappen ist nur unzureichend dokumentiert, könnte aber der Hauptregulator der Wandphysiologie und Pathobiologie mit funktionellen und strukturellen Rollen sein50. Das neuronale Netzwerk in der Adventitia setzt adrenerge, cholinerge, peptidische, purinerge und nitrerge Neurotransmitter frei, die zu einer SMC-Kontraktion oder -Entspannung führen50. Die Identifizierung dieser Antikörper im HCCV ist im Gange, wobei die Verfügbarkeit schafspezifischer Antikörper begrenzt ist. Die Adventitia ist auch eine Quelle residenter Stamm- und Vorläuferzellen für die Zellerneuerung und -differenzierung50,51.

Die Entwicklung mehrerer Schichten in der Sinuswand begann in Woche 3 und umfasste in Woche 9 eine Intimaschicht mit elastischen Fasern und Fibroblasten, eine Neomedia mit Myofibroblasten-ähnlichen Zellen und elastischen Fasern sowie eine umlaufende Faserschicht um die innere Stütze verbunden mit Kollagenbrücken. Dies fungierte als Hauptstütze für die Sinuswand. Die Neoadventitia begann nach 3 Wochen aufzutreten und nahm zunehmend an Größe zu. Es ist bekannt, dass dies eine wichtige regulatorische Rolle bei der Funktion von Gefäßen spielt52. Dieser frühe Umbau des HCCV ist günstig, da sich das Gerüst ab dem Zeitpunkt der Implantation zu zersetzen beginnt. Im Gegensatz dazu wurde eine frühe intimale Abdeckung der XPV- und Gen-1-Klappen nicht dokumentiert, da der früheste Zeitpunkt der Studien 2 bzw. 3 Monate betrug18,28.

Der Prozess der Morphogenese war in den Nebenhöhlen um 26 Wochen fortgeschritten, was auf die Designmerkmale, insbesondere die Einbeziehung der gestrickten Stütze in den Nebenhöhlen, zurückgeführt wurde. Die Neubesiedelung der Klappensegel und des Scharniermechanismus verlief deutlich langsamer, was ähnlich wie bei Xeltis und den Gen 1- und 2-Klappen ist18,28. Kluin et al. zeigten bereits nach zwei Monaten, dass in der gesamten mikroporösen Struktur ihrer Klappe reichlich zirkulierende Zellen vorhanden waren53.

Die vielfältige Population der Zellen, die das Gerüst neu besiedeln, stammt aus zirkulierenden Zellen. Sie dringen von der Adventitia-Oberfläche und von der Lumenseite in das Gerüst ein, und ersterer scheint der dominierende Weg zu sein. Das Neo-Gefäßsystem kann als zusätzliche Eintrittsstelle für Zellen fungieren, und der Pannus, der sich über das HCCV erstreckt, ermöglicht auch die Zellrekrutierung aus einem nahegelegenen Gewebe. Zukünftige Studien sind erforderlich, um Wege für die Zellrekrutierung in Neo-Flugblätter zu identifizieren.

Alle diese Prozesse führten zu einer hochfunktionellen Klappe mit schnellem Öffnen und ohne Anzeichen einer Obstruktion oder Regurgitation. Die Reaktion des rechten Ventrikels und das Flussmuster in der distalen Arterie spiegelten die anspruchsvolle Funktion einer lebenden Klappe wider. Sequentielle Echos und MRTs haben eine erhaltene Sinusform des HCCV, eine erhaltene rechtsventrikuläre Größe und ein erhaltenes Flussmuster im Vergleich zu normalen Schafen sowie das Fehlen einer Stenose gezeigt. Die aktuelle Studie ist die erste, die eine sequenzielle MRT nach der Implantation verwendet, um sowohl anatomische als auch funktionelle Daten im Zusammenhang mit dem HCCV zu erhalten.

Das Zurückziehen der Klappensegel war bei durch Gewebezüchtung hergestellten Klappen problematisch, wurde jedoch in unserer Studie nur bei 1 von 12 Klappensegeln beobachtet, vergleichsweise weniger als in anderen Studien. Um diesem Problem des Zurückziehens vorzubeugen/umzugehen, wurde das HCCV mit einem längeren Mittelflügel entworfen, um die Koaptation aufrechtzuerhalten. Auch bei anderen Klappen aus Gewebezüchtung kam es in einigen Fällen zu einer leichten und starken Einfaltung bis zu dem Grad, dass das Segel mit der Sinuswand verschmolzen war18,54, es kam zu einer Schrumpfung aller Klappen10,55 und zu einer signifikanten Verringerung der mittleren Höckerlänge54,56.

Sowohl das nanofaserige PCL- als auch das makrofaserige PCL-Garn zeigten laut GPC ein ähnliches Ausmaß an Abbau, was darauf hindeutet, dass der hydrolytische Abbau die hauptsächliche Art des Abbaus ist und nicht der zelluläre enzymatische Abbau, da die Nebenhöhlen im Vergleich zu den Blättchen stark mit Zellen besiedelt waren. Im Gegensatz dazu zeigte die Xeltis-Klappe eine fortgeschrittenere Absorption/Abbau im Conduit im Vergleich zu den Klappensegeln18, basierend auf der Verwendung unterschiedlicher Polymere mit unterschiedlichen Abbauraten an jeder Stelle. Die von Kluin et al. hergestellte Stentklappe. zeigten eine leichte Abnahme des Molekulargewichts aller Fasern mit dem Verschwinden des Polymers nach 12 Monaten in zellreichen Regionen53.

Ein sehr kleiner Verkalkungsknoten wurde nach 6 Monaten nur in einem Blättchen von vier HCCVs und in keinem der Nebenhöhlen beobachtet. Dies ist ein ähnliches Ergebnis wie bei der Xeltis-Klappe mit Blättchenverkalkung in einem Blättchen von 5 Klappen18 und bei einer Dreirohrklappe, die in einigen Blättchenregionen punktförmige Mikroverkalkung aufwies28. Kluin et al. zeigten, dass in zwei 12-Monats-Explantaten nur spärliche Flecken vorhanden waren53. Das Schafmodell ist besonders anfällig für Verkalkungen, daher ist unser Ergebnis ein positives Ergebnis.

Zu den Einschränkungen der Studie zählen die geringe Anzahl an Tieren zu frühen Zeitpunkten, die relativ kurze Nachbeobachtungszeit und das Fehlen von Experimenten zum Nachweis der Wachstumsfähigkeit. Die langsamere Neubesiedelung der Blättchen erfordert weitere Untersuchungen und ähnelt anderen Klappen12,28. Die Beobachtung kleiner Risse bei 7 der 15 HCCVs stellt eine weitere Einschränkung dar, obwohl die Risse bei einem Explantat auf eine Infektion zurückzuführen waren; Allerdings waren diese Risse extrem klein und von lebendem Gewebe umgeben, was die Ausbreitung einschränken und die Heilung fördern könnte. Diese Risse traten an Stellen mit hoher Belastung auf, an den Verbindungskanten und Kommissuren, und das Risiko eines Risses würde durch eine leichte Verdickung der Blättchen verringert.

Neuartige Erkenntnisse zur Umgestaltung des HCCV zeigen eine frühe Elastogenese in den Nebenhöhlen mit Adipogenese an der äußeren Nebenhöhlenwand, die auch angiogene und neurogene Systeme umfasst. Die Dokumentation der Repopulation des HCCV mit geeigneten Zellen und ECM, sowohl strukturell als auch funktionell, ist äußerst vielversprechend und sollte bei der Anwendung beim Menschen zu klinisch relevanten Ergebnissen führen, sowohl im Hinblick auf die Lebensqualität als auch auf die Langlebigkeit.

Die Entwicklung und Herstellung des HCCV umfasste einen mehrstufigen Prozess. Zunächst basierte die 3D-Modellierung der Lungenwurzel auf Bildern normaler Aortenwurzeln, die vom Assuan-Herzzentrum bereitgestellt wurden. Die Bilder wurden mit Mimics (Materialise NV, Belgien) segmentiert und zur Erstellung von Formen in Solidworks (Dassault Systèmes) verwendet. Das Design wurde leicht modifiziert, um die Längskrümmung der Valsalva-Nebenhöhlen und die Höhe der Segel zu erweitern, um die Wechselwirkung zwischen Flüssigkeit und Feststoff zu verbessern und die Koaptation zu verbessern23 (Abb. 1c). Es wurde ein computergestütztes Designmodell (CAD) mit einer Ringgröße von 25 mm erstellt, das die äußere Geometrie (Abb. 1d) sowie die Segeloberflächen (Abb. 1e) darstellt. Jeder Höcker wurde separat mit einem abnehmbaren Gegengewicht modelliert, um eine Hochgeschwindigkeitsrotation zu ermöglichen. Ein Halter und eine Gegenform wurden entwickelt, um die drei Höcker mit Hilfe einer Y-Struktur zusammenzuhalten und so die Form der Wurzel nachzuahmen. Die einzelnen Formen wurden mit einem 3D-Drucker (Ultimaker 3) in Polyvinylalkohol (PVA) 3D-gedruckt, mit Ausnahme der Y-Struktur, die zur mechanischen Unterstützung CNC-gefräst aus Titan gefertigt wurde (Protolab) (Abb. 1e). Zweitens: Strahlsprühen von Nanofasergerüsten: Dieser Prozess wurde bereits beschrieben und modifiziert, um ihn an den Sprühprozess für mehrteilige Formen anzupassen22. Kurz gesagt, Druckluft wurde durch einen speziell angefertigten Strahlzerstäuber geleitet, während die 10 % w/v Polycaprolacton (PCL)-Lösung mit einer Spritzenpumpe (Alaris Guardrails Plus) mit 35 ml/Stunde extrudiert wurde. Der Jet-Sprüher wurde bei einem Druck von 7 bar über eine konische Edelstahldüse mit einem Durchmesser von 500 µm und einer Nadel mit einem Durchmesser von 120 µm betrieben. Der Strahlsprüher ist auf einem XYZ-Tisch montiert, um die PCL-Nanofaser in einem Abstand von 30 cm auf die Formen zu sprühen. Jede Sinusform wurde in einem rotierenden Dorn montiert und mit 10.000 U/min mit einer geschätzten Oberflächengeschwindigkeit von 12,38 m/s für die Höckerform gedreht, um ausgerichtete Nanofasern zu bilden. Alle 3 Höcker wurden separat besprüht und dann wie in Abb. 1e, f gezeigt in den Halter montiert. Die zusammengebaute Form wurde mit einem Strahlspray bei 500 U/min und einer durchschnittlichen Oberflächengeschwindigkeit von 0,65 m/s besprüht, um die erste nicht ausgerichtete Außenschicht zu bilden. Die Dicke der Nanofaserschichten wurde mit einem berührungslosen konfokalen Dickenprofilmessgerät (Micro-epsilon, UK) mit 10 Messpunkten pro Modell gemessen. Drittens: Erstellung einer gestrickten Stützstruktur: Mit der Stricksoftware Stoll M1 plus wurden verschiedene Bereiche der Stützstruktur mit unterschiedlichen Spannungen entworfen, um dem Lungendruck standzuhalten und die Nahtretention zu unterstützen (Patent EP 3 552 577 B1). PCL-Garn, 220 dtex (EMS-Griltech), wird zum Kettenstricken eines bestimmten Musters mit regionalen Spannungen verwendet, um sich an die Form und Steifigkeit des normalen Ventils anzupassen und gleichzeitig eine Ausdehnung in Umfangsrichtung (Abb. 1i) auf einem Stoll-Flat zu ermöglichen -Bettstrickmaschine (Stoll, UK). Die gestrickte Stütze mit proximalen und distalen Nähringen wurde auf die Nebenhöhlen (Abb. 1h) über der besprühten zusammengebauten Klappe gelegt und dann erneut mit einem Strahl bei 500 U/min besprüht, wie zuvor beschrieben. Zuletzt das Lösungsmittelschweißverfahren: Ethylacetat wurde verwendet, um die PCL-Fasern zwischen den äußeren Sinusschichten der Sinusformen und der gesamten Außenschicht über die gesamten 3 Sinusformen zu verschweißen. Der Prozess wurde optimiert, um eine gute Haftung zwischen den PCL-Schichten zu gewährleisten und gleichzeitig die Porosität für die Zellpenetration aufrechtzuerhalten. Dies wurde durch 30-minütiges Lösungsmittelschweißen mit 15 ml Ethylacetat bei 30 °C unter Verwendung einer speziell angefertigten luftdichten 2-Liter-Kammer erreicht. Die Form mit der äußeren Sprühschicht wurde in eine luftdichte Kammer gestellt, die einen Temperaturfühler enthielt, und zur homogenen Verteilung des Ethylacetatdampfes auf einen Rotator gestellt. Dies gewährleistete eine Sättigung der Kammer und ein gleichmäßiges Lösungsmittelschweißen. Die fertigen Ventile wurden 48 Stunden lang unter Vakuum in einen Exsikkator gestellt, um etwaiges restliches Lösungsmittel zu entfernen. Nach der Entfernung des restlichen Lösungsmittels wurde das Strahlventil in ein Wasserbad bei 45 °C getaucht, damit sich die PVA-Formen auflösten. Als sich die Formen auflösten, wurde die Y-Strebe entfernt, um eine Beschädigung der Höcker zu verhindern. Sobald das Ventil vollständig aufgelöst war, wurde es in einem Laminar-Flow-Schrank getrocknet, nachdem es dreimal im Abstand von einer Stunde mit 100 % Ethanol ausgetauscht wurde. Die getrockneten Ventile wurden vor der In-vivo-Implementierung zur Ethylenoxid-Sterilisation bei 35 °C (Test Ltd, UK) geschickt.

Das resultierende Gerüst besteht aus einem biokompatiblen, bioresorbierbaren, azellulären, porösen Polycaprolacton (PCL)-Polymer mit der spezifischen Geometrie einer menschlichen, natürlichen Halbmondklappe (Abb. 1j–l). Die Sinuswände bestanden aus einem gestrickten Träger, der in strahlgesprühte PCL-Nanofasern eingebettet war (Abb. 1m), und die Blättchen bestanden nur aus strahlgesprühten Nanofasern (Abb. 1n).

Strahlgesprühte Nanofasern und gestrickte Träger wurden mit Kohlenstoffband auf Aluminiumprobenhaltern befestigt und mit Gold/Palladium beschichtet (Emitech K550X, Quorum Technologies Ltd, Kent, UK). Die Bilder wurden mit dem analytischen Rastermikroskop JEOL JSM 6010LA aufgenommen. Die erfassten Bilder wurden mit Image J analysiert.

Die hydrodynamische Leistung des HCCV wurde mit einem Pulsduplikator (Vivitro Superpump System SP3891, Vivitro, Victoria, BC, Kanada) bewertet. Physiologisch äquivalente Lungendrücke und -flüsse wurden gemäß den Anforderungen von ISO 5840-2:2021 reproduziert. Die Klappe wurde an der Aortentestkammer montiert und bei einem Herzzeitvolumen (COs) von 7 l/min, einer 2-l-Compliance-Kammer, einem viskoelastischen Impedanzadapter mit Quell- und Output-Compliance auf 10 ml und 40 ml sowie einem mittleren arteriellen Druck von 20 mmHg, eine feste Herzfrequenz von 70 Schlägen pro Minute und eine Systole, die 35 % des Herzzyklus einnimmt. Als Testflüssigkeit wurde 37 °C warme Kochsalzlösung verwendet. Die ViViTest-Software wurde verwendet, um den stabilen mittleren arteriellen Druck, den Herzzeitvolumenfluss sowie Messungen des Vorhof-, Ventrikel- und Aortendrucks sowie des Aortenflusses über 10 aufeinanderfolgende Herzzyklen aufzuzeichnen. Die gesamte Regurgitant-Fraktion stellt das Regurgitant-Volumen dar, ausgedrückt als Prozentsatz des Schlagvolumens57. Die effektive Öffnungsfläche (EOA), die die minimale Querschnittsfläche des stromabwärts aus der Aortenklappenöffnung austretenden Strahls darstellt, wurde aus der Kontinuitätsgleichung unter Anwendung der Gorlin-Formel58 abgeleitet. Der Prozentsatz der geometrischen Öffnungsfläche wurde mit einer Hochgeschwindigkeitskamera mit 480 Bildern pro Sekunde (Sony, UK) erfasst, gefolgt von einem hauseigenen Matlab-Code (Mathworks) für die Bildanalyse59.

Die funktionelle Haltbarkeit des Ventils wurde in einem beschleunigten In-vitro-Verschleißtest (AWT) unter Verwendung eines VDT3600i AWT-Systems (BDC Laboratories, CO, USA) bewertet. Das Ventil wurde in einer Testkammer mit 37 ± 1 °C gepufferter Kochsalzlösung mit 1 g/l Natriumazid-Testflüssigkeit als Fungizid und Bakterizid montiert und mit einer Zyklusrate von 5 Hz betrieben, die so eingestellt war, dass ein Spitzendifferenzdruck über 40 mmHg aufrechterhalten wurde über das geschlossene Ventil für mindestens 5 % jedes Zyklus. Die Systemsoftware ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung der Differenzdrücke in Echtzeit und zeichnet nur die Zyklen auf, bei denen die Druckbedingungen den festgelegten Testanforderungen entsprachen. Der Test wurde so eingestellt, dass er bis zum Scheitern läuft. Das Ventil wurde täglich visuell auf Anzeichen von Schäden untersucht und alle 5 Millionen Zyklen vor und nach Abschluss im Pulsduplikator funktionsfähig bewertet.

Zwei Schafmodellstudien wurden bei Mfd Diagnostics GmbH (Wendelsheim, Deutschland) (Ethische Genehmigung des Protokolls G18-15-067 vom Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Deutschland) von einem unabhängigen Labor und ggf. örtlichen deutschen Behörden sowie in einer niederländischen Einrichtung durchgeführt nach ethischer Genehmigung. In den Niederlanden wurde eine Modellstudie mit Schafen durchgeführt. Die Genehmigung für die Tierversuche wurde von der Tierpflege-Ethikkommission des Amsterdam University Medical Centers (AVD1180020197705) eingeholt und steht im Einklang mit dem aktuellen niederländischen Tierversuchsgesetz (WOD). Bisher wurde bei 24 Schafen ein Pulmonalklappenersatz mittels HCCV durchgeführt (ergänzende Abbildung 2), und die Schafe wurden für die Nachbeobachtungsdauer randomisiert. Die Klappe wurde in verschiedenen Abständen nach der Operation explantiert: 1 Woche (n = 1), 2 Wochen (n = 1), 3 Wochen (n = 1), 9 Wochen (n = 1), 12 Wochen (n = 7). und 26 Wochen (n = 4). Bei 24 weiblichen Swifter-Schafen (Durchschnittsgewicht 50 ± 5 kg, Durchschnittsalter 1 Jahr) wurden die Pulmonalklappe und die Hauptpulmonalarterie durch das 25-mm-HCCV ersetzt. Für die Implantation in Deutschland wurde die Anästhesie mit 2 mg/kg Ketamin, 0,02 mg/kg Atropin und einer intravenösen Bolusinfusion von 2 mg/kg Propofol eingeleitet. Die Anästhesie wurde durch die kontinuierliche Gabe von Propofol aufrechterhalten. Das Herz wurde durch eine linke anterolaterale Thorakotomie freigelegt, die durch den 4. Interkostalraum in die Brust führte. Die systemische Antikoagulation wurde mit 400 IE Heparin pro Kilogramm induziert. Mittels femoraler arterieller und rechter atrialer venöser Kanülierung wurde ein normothermer kardiopulmonaler Bypass etabliert. Zur Sicherstellung der Anästhesie wurden im Bypass 0,01 mg/kg Fentanyl und 0,02 mg/kg Pancuronium verabreicht. Bei schlagendem Herzen wurde die Pulmonalarterie durchtrennt und ein Abschnitt der Hauptpulmonalarterie sowie alle drei natürlichen Blättchen entfernt. Der Klappenkanal wurde mit laufenden 5-0-Monofilamentnähten (Prolene, Ethicon, Inc.) implantiert. Heparin wurde nach der Entwöhnung vom Bypass mit 300 IE Protamin pro Kilogramm umgekehrt. Die Brustwand wurde schichtweise mit resorbierbaren Nähten verschlossen und eine Interkostalnervenblockade mit 0,25 % Bupivacain verabreicht. Es wurde keine weitere Antikoagulation verabreicht. Alle Tiere erhielten in der ersten postoperativen Woche täglich 1000 mg Cefazolin (Apothecon). Zur Schmerzkontrolle wurden in den ersten drei Tagen und danach bei Bedarf intramuskuläre Buprenorphin-Injektionen verabreicht. Alle Tiere erhielten eine humane Pflege gemäß dem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“, veröffentlicht von den National Institutes of Health (National Institutes of Health-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1985). Eine Echokardiographie wurde 4 und 8 Wochen nach der Implantation durchgeführt.

In den Niederlanden stammten alle Tiere von einem örtlichen Bauernhof und wurden zu Bildungszwecken gezüchtet. Ihr allgemeiner Gesundheitszustand wurde bei der Ankunft überprüft. Sie wurden vor dem Experiment mindestens 14 Tage lang einer Verfahrensakklimatisierung unterzogen. Wir führten einmal pro Woche eine detaillierte Tierschutzbewertung durch, bei der alle Tiere gründlich auf klinische Symptome oder Beschwerden untersucht wurden. Alle Tiere wurden in Gruppen von 2 bis 10 Tieren auf Weizenstroheinstreu untergebracht (Nijssen Fourages, Nieuw-Vennep, Niederlande). Die Tiere wurden mit Schaffutterpellets (250 g pro Tag; Kasper Faunafood, Woerden, Niederlande) gefüttert und hatten nach Belieben Zugang zu Wiesenheu (Nijssen Fourages, Nieuw-Vennep, Niederlande) und Leitungswasser. Die Schafe wurden in einem klimatisierten Raum mit einer Temperatur zwischen 15 und 21 °C und einem 12-Stunden-12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus gehalten. Für die Implantation wurde das folgende Protokoll befolgt: Die Antibiotikabehandlung wurde 2 Tage vor der Operation begonnen und bis 5 Tage nach der Operation mit Procain-Benzylpenicillin/Dihydrostreptomycin (1 ml/20 kg IM, Depomycin, 200.000 IE/200 mg/ml, MSD Animal Health) fortgesetzt , Kenilworth, USA). Ein Buprenorphin-Pflaster (5 µg/h-Pflaster; BuTrans, Mundipharma, Cambridge, UK) wurde einen Tag vor der Aortenklappenoperation auf die rasierte ventrale Seite des proximalen Teils des Schwanzes geklebt, um eine präventive Analgesie zu gewährleisten. Am Tag der Operation Ketamin/Hydrochlorin (10 mg/kg IM; Narketan 100 mg/ml, Vétoquinol, Paris, Frankreich) und Midazolam (0,4 mg/kg IM; Midazolam Actavis 5 mg/ml, Actavis, New Jersey). , USA) wurden als präanästhetische Medikamente verabreicht. Propofol wurde zur Einleitung (2 bis 4 mg/kg i.v.; Propofol 20 mg/ml, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland) und zur Aufrechterhaltung der Anästhesie (20 mg/kg/h i.v.) während der Operation verwendet. Sufentanil (5 µg/kg i.v.; Sufentanil-Hameln, 50 µg/ml, Hameln, Gloucester, UK) wurde zur Schmerzlinderung während der Operation verabreicht. Vor Beginn des kardiopulmonalen Bypasses (CPB) wurde eine Einzeldosis Amiodaronhydrochlorid (300 mg i.v., Cordaron 50 mg/ml, Sanofi, Paris, Frankreich) in den Infusionsbeutel mit Kochsalzlösung gegeben. Die Schmerzlinderung bestand aus einem Buprenorphin-Pflaster (5 µg/h-Pflaster, BuTrans, Mundipharma, Cambridge, UK) 1 Tag vor der Operation bis Tag 7 nach der Operation, Flunixinemeglumin (0,02 ml/kg IM, Niglumin, 50 mg/ml, Dopharma). , Raamsdonksveer, Niederlande) am Tag 1 nach der Operation bis zum 3. Tag und Meloxicam (1 mg/kg oral, Metacam, 20 mg/ml, Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Deutschland) vom ersten Tag nach der Operation bis zum 30. Tag. Als Antikoagulation Nadroparin (3800 IE IM, Fraxiparin, 9.500 IE/ml, Aspen, Durban, Südafrika) wurde vom ersten bis zum 30. Tag nach der Operation verabreicht. Furosemid (20 mg IM, Centrafarm, 20 mg/2 ml, Furosemide, Etten Leur, Niederlande) wurde zwischen Tag 1 und Tag 7 als Diuretikum verabreicht. Depomycin wurde in der ersten postoperativen Woche täglich als Antibiotikum verabreicht. Ultraschallmessungen wurden direkt nach der Implantation, 2 Monate und 1 Tag vor der Explantation, durchgeführt.

Während während der MRT-Untersuchung weiterhin eine Erhaltungsanästhesie verabreicht wurde, wurden die Tiere nach der MRT-Untersuchung in den Operationssaal transportiert, woraufhin mit der Klappenexplantation begonnen wurde. Der Druckgradient über der Pulmonalklappe wurde invasiv im rechten Ventrikel und in der Pulmonalarterie gemessen, woraufhin die Tiere unter Vollnarkose entblutet wurden. Danach wurde die Herzklappenprothese vorsichtig explantiert und 24 Stunden lang in 10 % Formaldehyd gelagert, bevor sie in PBS übertragen wurde. Proben von Leber, Lunge, Milz, Nieren, linkem und rechtem Ventrikel wurden gesammelt und 24 Stunden lang in 10 % Formaldehyd gelagert, bevor sie in PBS übertragen wurden.

Am Tag der Explantation wurden alle Schafe unter Vollnarkose (MRT-Techniker Anke Wassink und Raschel van Luijk, Niederlande) einer Herz-MRT-Untersuchung mit einem 1,5-T-Ingenia-Scanner (Philips, Niederlande) unterzogen. Darüber hinaus wurden drei weitere Schafe, bei denen keine Herzklappenimplantation durchgeführt wurde, auf ähnliche Weise einer MRT-Untersuchung unterzogen, um als gesunde Kontrollen zu dienen. Am Tag der MRT-Untersuchung erhielten alle Tiere Ketamin/Hydrochlorin (10 mg/kg IM; Narketan 100 mg/ml, Vétoquinol, Paris, Frankreich) und Midazolam (0,4 mg/kg IM; Midazolam Actavis 5 mg/ml). Actavis, New Jersey, USA) als Präanästhetikum. Propofol wurde als Induktionsanästhesie (2–4 mg/kg i.v.; Propofol 20 mg/ml, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland) und als Erhaltungsanästhesie (4–7 mg/kg i.v.; Propofol 20 mg/ml, Fresenius Kabi) verwendet , Bad Homburg, Deutschland) zusätzlich zu Sufentanil (5 μg/kg i.v.; Sufentanil-Hameln, 50 mcg/ml, Hameln, Gloucester, UK).

Das systolische und diastolische Volumen wurde mithilfe einer retrospektiven Elektrokardiogramm-gesteuerten Steady-State-Präzessionssequenz ermittelt. Es wurden vertikale 2- und 4-Kammer-Langachsenansichten und Kurzachsenansichten bestehend aus 12 bis 14 zusammenhängenden Schichten aufgenommen, die beide Ventrikel von der Herzbasis bis zur Herzspitze abdecken. Scan-Parameter waren; Wiederholungszeit = 3,2 bis 3,8 ms; Echozeit = 1,6 bis 1,9 ms; Flipwinkel = 50–70o; Scheibendicke = 6–8 mm ohne Scheibenspalt; Matrix = 160 × 256; Sichtfeld = 350–400 mm und zeitliche Auflösung ca. 25 ms.

2D-CMR Die Strömungsdynamik über die Lungenarterie wurde mithilfe einer retrospektiven elektrokardiogrammgesteuerten geschwindigkeitskodierten MRT-Sequenz beurteilt. Die Sequenz wurde für eine Geschwindigkeit durch die Ebene von 150 cm/s oder höher kodiert, je nach Grad der Hauptpulmonalarterie. Die Scanparameter waren Wiederholungszeit = 9 ms, Echozeit = 5 ms, Flipwinkel = 15–20°, Schichtdicke = 6–8 mm, Matrix = 128 × 256, zeitliche Auflösung ca. 20 ms.

Die biventrikuläre systolische Funktion und der 2D-Fluss wurden mit der Software CVI 42 (Circle Cardiocular Imaging, Calgary, Kanada) analysiert. Die biventrikuläre systolische Funktion wurde durch Zeichnen endokardialer LV- und RV-Konturen an der Enddiastole und Endsystole in allen Abschnitten des Cine-Kurzfilms beurteilt. Achsdaten. Enddiastolische Volumina (EDV) und end-systolische Volumina (ESV) wurden ermittelt und gemäß der Mosteller-Formel für die Körperoberfläche indiziert: (√ Größe (cm) × Gewicht (kg)/3600). Das für die Körperoberfläche indizierte ventrikuläre Schlagvolumen wurde durch Subtrahieren des ESV vom EDV berechnet. Die Ejektionsfraktion wurde berechnet, indem das Schlagvolumen durch den EDV dividiert wurde.

Für die Lungenarterie wurden Gefäßkonturen gezeichnet, um Fluss-Zeit-Kurven über den gesamten Herzzyklus hinweg zu erzeugen. Vorwärtsfluss, Rückwärtsfluss und Nettofluss wurden gemessen. Das Herzzeitvolumen (CO) (Nettopulmonalfluss) wurde als Produkt aus Nettofluss und Herzfrequenz gemessen. Der Herzindex (CI) (Lungenfluss) war der CO-Index der Körperoberfläche (KOF).

CFD wurde durchgeführt, um Strömungsmuster, „Wirbel“-Helixentwicklung durch die Haupt-PA, LPA und RPA durch farbcodierte Stromlinien, Vektorgeschwindigkeiten, Wirbel- und Helizitätskonturdiagramme mit Fluent (ANSYS Inc., Canonsburg, PA, USA) zu visualisieren. . Die 3D-Rekonstruktion (Segmentierung) der Haupt-PA, LPA und RPA wurde mit Mimics (Materialise NV, Belgien) durchgeführt, um den Bereich des CFD zu definieren. Der Flüssigkeitsbereich wurde als Blut mit einer Dichte von 1060 kg/m3 und einer Viskosität von 0,0035 Pa·s definiert. Die Randbedingungen wurden unter Verwendung einer Einlass-Randbedingung von Geschwindigkeitsdaten auf Ventilebene und Druck-Auslass-Randbedingungen am LPA und RPA definiert. Die Einlassgeschwindigkeitsdaten wurden aus 2D-CMR-Durchflussdaten auf Ventilebene abgeleitet.

Die Querschnittsfläche der Wurzel bei der maximalen Sinuswölbung wurde zur Berechnung der Umfangsdehnung der Wurzel verwendet. Dies wurde als (Amax − Amin)/Amin berechnet, wobei Amax und Amin die maximale bzw. minimale Fläche während des Herzzyklus darstellen.

Insgesamt 5 μm dicke Paraffinschnitte von ILT wurden in Leitungswasser gewaschen, 5 Minuten lang mit Mayer-Hämatoxylin gefärbt und anschließend mit Leitungswasser gewaschen. Anschließend wurden die Objektträger 5 Minuten lang mit 1 % Eosin-Färbung inkubiert. Kurz mit Leitungswasser gespült und schnell durch abgestuftes Methanol dehydriert, in Xylol geklärt und in DPX montiert.

5 μm dicke Paraffinschnitte wurden in destilliertem Wasser gewaschen und 10 Minuten lang mit Weigerts Hämatoxylin gefärbt. Anschließend wurde mit Leitungswasser und destilliertem Wasser gewaschen. Die Schnitte wurden dann 20 Minuten lang mit 3 % Alcianblau und anschließend 20 Minuten lang mit 1 % Molybdophosphorsäure inkubiert. Nach einer kurzen Wäsche mit destilliertem Wasser wurden die Schnitte 60 Minuten lang mit Siriusrot/Pikrinsäure gefärbt. Die gefärbten Objektträger wurden kurz in destilliertem Wasser gewaschen, schnell durch abgestuftes, in Xylol geklärtes Methanol dehydriert und in DPX montiert.

5 μm dicke Paraffinschnitte wurden in destilliertem Wasser gewaschen, in 100 % Methanol gespült, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in Millers Elastin-Färbung (VWR) eingetaucht, 10–20 Sekunden lang in 90 % Methanol differenziert, anschließend gut in Leitungswasser gewaschen destilliertes Wasser, 5 Minuten lang in Van-Giesson-Färbung eingetaucht, kurz in destilliertem Wasser gespült, schnell durch abgestuftes Methanol dehydriert, in Xylol geklärt und in DPX montiert.

Die Klappen wurden nach 1 Woche, 2 Wochen, 9 Wochen, 13 Wochen und 26 Wochen explantiert und mit PBS gewaschen und 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die vordere Wurzel, die linke hintere und die rechte hintere Wurzel wurden herauspräpariert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurden die Proben in 10 %ige Formol-Kochsalzlösung getaucht und zu Paraffinblöcken verarbeitet. 5 µm dicke Paraffinschnitte wurden geschnitten, entparaffiniert und zu Wasser rehydriert. Der Antigen-Retravel wurde in 0,1 M Citratpuffer (pH 6) durchgeführt und 10 Minuten lang bei hoher Leistung in der Mikrowelle behandelt. Weitere 20 Minuten lang abkühlen lassen, bevor endogene Peroxidasen unter Verwendung von 0,3 % Wasserstoffperoxid in PBS blockiert wurden. Die Schnitte wurden zweimal in PBS gewaschen und mit 10 % normalem Pferdeserum in 2 % Rinderserumalbumin (w/v) (BSA) in PBS mit 1 % v/v Tween-20 blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit den in der Ergänzungstabelle aufgeführten Primärantikörpern 1, über Nacht im Kühlschrank. Primärantikörper wurden dann durch dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS und anschließendem Vectastain (R) Elite ABC-HRP-Kit, Peroxidase RTU (Universalkit) entfernt. Die Reaktivität wurde unter Verwendung von Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB-Tabletten – Sigma) (25 mg/ml) und Wasserstoff nachgewiesen Peroxid (0,01 % w/v). Anschließend wurden die Schnitte mit Mayers-Hämatoxylin gegengefärbt und die gefärbten Objektträger mit Hamamatsu Nanozoomer gescannt.

Vor der Immunfluoreszenzfärbung wurden 5 µm dicke Paraffinschnitte von Schafexplantaten entwachst und zu Wasser rehydriert. Die Antigengewinnung erfolgte durch Mikrowellenbehandlung der Objektträger in 0,1 M Citratpuffer. Um die unspezifische Bindung zu reduzieren, wurden die Objektträger 40 Minuten lang mit 10 % normalem Ziegenserum in 2 % Rinderserumalbumin (BSA-Sigma) inkubiert. Die Proben wurden dann über Nacht in einer feuchten Kammer mit einem Antikörpercocktail bestehend aus Alpha-Aktin der glatten Muskulatur (Maus von DAKO) und CD31 (Kaninchen-Abcam) inkubiert. Negative Kontrollen bestanden aus 10 % normalem Ziegenserum in 2 % BSA in PBS. Nach gründlichem Waschen wurden alle Proben mit Sekundärantikörpern, Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor-634 für polyklonale Kaninchen-Antikörper und Ziegen-Anti-Maus-Alexa-Fluor-488 (Life Technologies) 1 Stunde lang bei einer Verdünnung von 1:1000 inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS wurden die Schnitte 15 Minuten lang mit DAPI (1:5000) (Sigma) inkubiert. Um die Autofluoreszenz zu reduzieren, wurden die Schnitte 3 Minuten lang mit dem Vector TrueView Quenching Kit (Vector Laboratories) inkubiert und mit Permafluor (Beckman Coulter) montiert. . Gefärbte Schnitte wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 880-Mikroskop abgebildet.

Die Silberfärbung von Nerven wurde gemäß der Silberfärbungsmethode von Bielschowsky durchgeführt, wie in „Theorie und Praxis histologischer Techniken“ von Bancroft und Stevens60 beschrieben.

Gewebestücke (2 mm2) wurden aus verschiedenen Bereichen der umgestalteten Klappe herausgeschnitten und 2 Stunden lang in 3 % Glutaraldehyd (Agar Scientific Ltd., Essex, UK) in 0,1 M Cacodylatpuffer fixiert. Nach zwei Pufferwaschungen wurde die sekundäre Fixierung mit 1 % Osmiumtetroxid (Agar Scientific Ltd.) in 0,1 M Cacodylatpuffer 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Probe wurde dann durch eine ansteigende Ethanolreihe, beginnend mit 25 % Ethanol, dehydriert. Nach der Dehydrierung wurde das Gewebe auf Propylenoxid (Sigma-Aldrich, UK) übertragen. Das Gewebe wurde dann über Nacht mit 1:1 Propylenoxid:Araldite CY212-Harz infiltriert. Nach zwei Wechseln des frischen Harzes für jeweils mindestens 3 Stunden wurde das Gewebe in Araldite CY212-Harz eingebettet und 18 Stunden lang bei 60 °C polymerisiert. Ultradünne Schnitte wurden mit einem Diatome-Diamantmesser auf einem Reichert-Jung-Ultracut-E-Ultramikrotom geschnitten, auf destilliertem Wasser geschwommen, auf Kupfergittern gesammelt und in jeder Lösung 10 Minuten lang mit 2 % Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden mit dem Elektronenmikroskop JEOL 1200 betrachtet und mit einer Gatan-Kamera wurden digitale Bilder aufgenommen.

Stücke von Klappensegel- und Sinuswandproben wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumkacodylatpuffer fixiert. Nach 2 Pufferwaschungen wurde die sekundäre Fixierung mit 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 M Cacodylatpuffer 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Proben wurden in aufsteigenden Ethanolreihen dehydriert, beginnend mit 20 % Ethanol. Anschließend wurden die Proben dreimal 2 Minuten lang in jeder Lösung mit Hexamethyldisilazan (HMDS-Sigma) behandelt, an der Luft getrocknet und auf REM-Stützen montiert. Die Stubs wurden mit Gold sputterbeschichtet und im JEOL JSM-5500 LV SEM (JEOL UK Ltd) betrachtet. Alle Chemikalien wurden von Agar Scientific Ltd, Stanstead, Essex, Großbritannien, bezogen.

Da eines der 9-Wochen-Explantate einen Kalkknoten aufwies, wurde eine Elementaranalyse mittels energiedispersiver Röntgenspektroskopie an einem entparaffinierten und rehydrierten 10 μm dicken Paraffinwachsschnitt durchgeführt, der luftgetrocknet und auf mit Gold/Gold beschichteten REM-Stubs montiert wurde. Palladium mit einem analytischen Rasterelektronenmikroskop JEOL 6010.

Proben (Größe 5 m × 5 mm) des Gewebe-/Gerüst-Komposits wurden 1 Stunde lang in 5 % NaOCl (Sigma) getaucht, um biologisches Gewebe zu entfernen, gefolgt von dreimaligem Waschen in dH2O, die PCL-Komponente wurde in 2 ml Chloroform (Sigma) gelöst ), gefolgt von Lufttrocknung und erneutem Auflösen mit THF (VWR) bei 1 mg/ml PCL/THF-Lösung. Die Proben wurden vor der Analyse mit einem PTFE-Filter bei 0,2 µm vorgefiltert. Die Proben wurden mit dem Agilent 1260 Infinity II GPC/Größenausschlusschromatographiesystem mit einer Flussrate von 1 ml/min bei 25 °C analysiert. Die gewichtsgemittelten Molekulargewichte (Mw) des PCL wurden unter Verwendung der Standardkurve (Mn, EXP = X × Mn, SEC) des Polystyrol-Standards (Agilent infinity lab EasiVial) mit den zuvor bestimmten Korrekturkoeffizienten

Alle statistischen Vergleiche wurden mit GraphPad Prism v10.0.1 durchgeführt. Alle Daten wurden auf Normalität getestet, sofern nicht anders angegeben. Analyse der hydrodynamischen In-vitro-Tests: Statistische Vergleiche zwischen der Kontrollgruppe (Freestyle Medtronic-Klappe) und der Versuchsgruppe (HCCV) wurden unter Verwendung eines zweiseitigen t-Tests mit einer Stichprobengröße von n = 4, unabhängigen Stichproben für jede Gruppe, durchgeführt. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde für die Analyse als statistisch signifikant angesehen.

Stammanalyse: Statistische Vergleiche wurden zwischen der HCCV-Gruppe und der Kontrollgruppe (einheimische Schafe) unter Verwendung eines zweiseitigen t-Tests unter der Annahme ungleicher Varianz durchgeführt. Die Stichprobengröße betrug n = 5 (biologisch unabhängige Proben) für die HCCV-Gruppe und n = 3 (biologisch unabhängige Proben) für die Kontrollgruppe. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

HCCV-Morphometrie (n = 4, biologisch unabhängige Proben) und GPC-Analyse (n = 3, biologisch unabhängige Proben): Statistische Vergleiche wurden unter Verwendung einer Einweg-ANOVA-Analyse gefolgt von einem Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest durchgeführt. Die Dicke der HCCV-Blätter vor und nach der Implantation wurde mithilfe eines zweiseitigen Mann-Whitney-Tests verglichen und ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten sind in den Zusatzdaten verfügbar.

Der benutzerdefinierte Matlab-Code für die GOA-Analyse ist über Github unter einer allgemeinen öffentlichen Lizenz frei verfügbar. Der Code ist unter https://doi.org/10.5281/zenodo.8275999 verfügbar.

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Die Studie wurde von Heart Biotech und dem Magdi Yacoub Institute unterstützt.

Magdi Yacoub Institute, Harefield, Großbritannien

Magdi H. Yacoub, Yuan-Tsan Tseng, Padmini Sarathchandra, Adrian H. Chester und Najma Latif

National Heart and Lung Institute, Imperial College London, London, Großbritannien

Magdi H. Yacoub, Yuan-Tsan Tseng, Ulrich Stock, Padmini Sarathchandra, Adrian H. Chester und Najma Latif

Assam Heart Science Center, Magdi Yacoub Foundation, Assam, Ägypten

Magdi H. Yacoub, Hussam El-Nashar, Nairouz Shehata, Mohamed Nagy, Amr El-sawy und Soha Romeih

Abteilung für Herz-Thorax-Chirurgie, Erasmus MC, Rotterdam, Niederlande

Jolanda Kluin

Amsterdam UMC, Universität Amsterdam, Abteilung für Herz-Thorax-Chirurgie, Amsterdam, Niederlande

Annemijn Vis

Royal Brompton und Harefield Hospital, London, Großbritannien

Ulrich Stock, Hassiba Smail & Wei Li

Herz-Kreislauf-Medizin, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, USA

Elena senden

Abteilung für Bioingenieurwesen, Imperial College London, London, Großbritannien

Hussam El-Nashar

Fakultät für Informatik, Imperial College London, London, Großbritannien

Nairouz Shehata

Labor für Herz-Kreislauf-Technik, UCL Mechanical Engineering, University College London, London, Großbritannien

Gaetano Burriesci & Jacob Salmonsmith

Bioengineering Unit, Ri.MED Foundation, Palermo, Italien

Gaetano Burriesci

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MHY, Y.-TT und NL trugen gleichermaßen zur Konzeption der Studie, zum experimentellen Design, zum Projektmanagement, zur Überwachung und zum Entwurf des Originalmanuskripts bei. MHY sicherte sich die Finanzierung. MHY, Y.-TT, NL und HE waren für die Konstruktion und Herstellung des HCCV-Ventils verantwortlich. Y.-TT, GB, JS, HE, AHC und NS haben die In-vitro-Validierung des Konstrukts entworfen und durchgeführt. JK, AV, US, HS, Y.-TT und NL führten In-vivo-Studien durch und überwachten die Datenerfassung. Wl analysierte die Echobilder. HE und AE-S. führte die CFD-Analyse durch. SR, MN, AE-S., HE und NS führten die CMR-Analyse durch. NL, PS, MHY, YT.T. und EA führten die Analyse der Explantate durch. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Magdi H. Yacoub.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden Interessen: MHY, Y.-TT und NL halten Anteile an Heart Biotech. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Communications Biology dankt Yuanjia Zhu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Ngan F. Huang und Joao Valente.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yacoub, MH, Tseng, YT., Kluin, J. et al. Durch ein azelluläres Gerüst induzierte Valvulogenese einer lebenden, innervierten Lungenwurzel. Commun Biol 6, 1017 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05383-z

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Eingegangen: 13. Dezember 2022

Angenommen: 21. September 2023

Veröffentlicht: 07. Oktober 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05383-z

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